掃碼咨詢相關(guān)分析套路的研究方法

細(xì)胞外囊泡（Extracellular vesicles，EV）可由細(xì)胞產(chǎn)生釋放的具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡結(jié)構(gòu)的統(tǒng)稱，根據(jù)其大小和生物發(fā)生過程可分為以下四種主要類型：外泌體（Exosomes，30-150nm）、微囊泡（MVs，100-1000nm）、凋亡小體（apoptotic body，50-5000nm）和癌小體（oncosomes，1-10μm）。以往的研究表明，外泌體的來源細(xì)胞種類非常豐富，幾乎在人體血液、尿液、母乳和唾液等多種體液中都能發(fā)現(xiàn)它的蹤跡。外泌體可以傳遞包括DNA、RNA、miRNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)在內(nèi)的多種生物活性物質(zhì)到受體細(xì)胞中，同時保護(hù)包裹的內(nèi)含物免受核酸酶和蛋白酶，以及外界壞境變化引起的降解和變性。也正是因為外泌體來源廣泛且包含特定細(xì)胞群的內(nèi)容物，還有其穩(wěn)定性和遠(yuǎn)程運(yùn)輸以及易獲取的特性，越來越多的研究將目光聚集在外泌體的診斷和預(yù)后的潛力。

那么，以外泌體開發(fā)新的生物標(biāo)志物具有哪些優(yōu)勢呢？①外泌體本身具有特定的濃度和類型，可以反應(yīng)個體健康狀況；②包含親代細(xì)胞的特定標(biāo)志物和內(nèi)含物，有助于鑒定親代細(xì)胞的狀態(tài)；③外泌體在外周循環(huán)中的豐富性是對已有檢測鑒定方法的拓展；④外泌體可以將其包含生物活性成分傳遞到受體細(xì)胞，分析內(nèi)含物種類和變化，可預(yù)測受體細(xì)胞的變化。基于以上優(yōu)勢，開發(fā)外泌體相關(guān)準(zhǔn)確且穩(wěn)定的生物標(biāo)志物對于臨床上的疾病診斷的早期預(yù)警具有極大的推動作用。

目前已經(jīng)有越來越多的研究證明基于外泌體相關(guān)RNA鑒定的生物學(xué)標(biāo)志物或者是開發(fā)的新的預(yù)后風(fēng)險模型均能夠表現(xiàn)出非常優(yōu)異的疾病診斷和預(yù)后效果。現(xiàn)在就跟大家介紹幾篇關(guān)于外泌體相關(guān)特征的研究文章。

外泌體相關(guān)特征的研究案例：

1.唾液衍生的外泌體小RNA作為食管癌生物標(biāo)志物

題目：A signature of saliva-derived exosomal small RNAs as predicting biomarker for esophageal carcinoma:a multicenter prospective study

DOI：10.1186/s12943-022-01499-8

食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)在全球癌癥發(fā)病率和癌癥死亡率方面排名第七，患者在診斷時通常處于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的優(yōu)勢階段，這導(dǎo)致5年生存率約為20%。迫切需要開發(fā)新的生物學(xué)標(biāo)志物應(yīng)用于ESCC患者的早期診斷以及更精確的分層以指導(dǎo)輔助治療。外泌體包含tRNA 衍生的小 RNA (tsRNA)在內(nèi)的多種的小RNA。tRNA衍生的小RNA (tsRNA)以核酸酶依賴性方式產(chǎn)生，以響應(yīng)癌癥中常見的各種壓力。本研究專注于富含癌癥的 tsRNA 特征，以開發(fā)基于唾液外泌體的非侵入性生物標(biāo)志物，用于人類食管鱗狀細(xì)胞癌 (ESCC)。

采集各3名ESCC患者和健康志愿者的樣本，分離外泌體并進(jìn)行鑒定。測序結(jié)果顯示，ESCC患者的外泌體中鑒定出1366個差異表達(dá)的 sesncRNA（不包括 miRNA）。挑選表達(dá)差異最顯著的前五名sesncRNA進(jìn)行表達(dá)檢測驗證，其中tRNA-GlyGCC-5和sRESE兩者表達(dá)差異P值小于0.01。使用特異性的反義RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，能顯著抑制體外癌癥細(xì)胞的多種惡性生物學(xué)行為。

分析收集的患者唾液樣本中sesncRNA的水平，發(fā)現(xiàn)在CHSUMC訓(xùn)練隊列（200名ESCC患者和120名對照）以及ATH驗證隊列（140名ESCC患者和60名對照）中均顯示ESCC患者的 tRNA-GlyGCC-5和sRESE顯著高于健康志愿者。此外，在 CHSUMC訓(xùn)練隊列，tRNA-GlyGCC-5和sRESE的接收者操作特征分析（AUROC）分別為0.878和0.871。將tRNA-GlyGCC-5和sRESE的表達(dá)值進(jìn)行邏輯回歸分析，建立bi-sesncRNA 特征風(fēng)險評分（RSD），ROC分析表明bi-sesncRNA簽名RSD比單獨(dú)的每個 sesncRNA 具有更好的性能（AUROC為0.933）。

為將雙sesncRNA特征評分應(yīng)用在ESCC預(yù)后中的潛在臨床效用，基于tRNA-GlyGCC-5、sRESE和bi-sesncRNA特征RSP的中值對CHSUMC隊列中的患者進(jìn)行分組。Kaplan-Meier分析顯示，在CHSUMC和ATH隊列中，低RSP組ESCC患者的總體生存期OS和無進(jìn)展生存期PFS顯著長于高RSP的患者。對比bi-sesncRNA與單獨(dú)的sesncRNA的預(yù)測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)bi-sesncRNA簽名很大程度上改善了OS和PFS的預(yù)測。

列線圖預(yù)測模型中，CHSUMC隊列和ATH隊列的3 年OS預(yù)測良好。再次證明，bi-sesncRNA特征RSP可以作為ESCC患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子

同樣基于bi-sesncRNA衍生RSP的截止值（-0.436），將ESCC患者進(jìn)行分組（高RSP組和低RSP組）。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示在CHSUMC隊列和ATH隊列中，只有高RSP亞組在接受輔助治療后患者OS和PFS能夠顯著延長。

2.循環(huán)外泌體RNA標(biāo)記是胰腺癌的潛在診斷標(biāo)志物

題目：Single-cell analysis of a tumor-derived exosome signature correlates with prognosis and immunotherapy response

DOI：10.1186/s12967-021-03053-4

基于兩個GSE100232和GSE100206數(shù)據(jù)集，對比胰腺癌患者和正常樣本中血液外泌體中的RNA的差別。通過火山圖可以看出胰腺癌患者血液中鑒定出大量差異表達(dá)的外泌體RNA。GSE133684數(shù)據(jù)集的分析也驗證了這一點(diǎn)。

為了評估差異循環(huán)外泌體RNA在區(qū)分胰腺癌患者或健康對照的健康狀況方面的表現(xiàn)，通過隨機(jī)森林模型并構(gòu)建了 ROC 曲線，對顯著差異基因的前10名進(jìn)行歸一化計數(shù)，曲線下面積（AUC）值為 1.0。

胰腺癌患者循環(huán)外泌體中差異表達(dá)RNA的通路富集采用IPA通路富集分析，結(jié)果顯示前五種經(jīng)典通路，包括氧化磷酸化、線粒體功能障礙、sirtuin信號通路、雌激素受體信號通路和蛋白質(zhì)泛素化通路。排名靠前的疾病/病癥分別為癌癥、機(jī)體損傷和異常、傳染病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病和胃腸道疾病。差異表達(dá)的循環(huán)外泌體 RNA 在基因表達(dá)、細(xì)胞死亡和存活、RNA 轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞周期這五個分子和細(xì)胞功能的五個主要特征上具有統(tǒng)計學(xué)意義。網(wǎng)絡(luò)分析表明核因子、鋅指和 RNA 聚合酶、上調(diào)癌基因 PVT1）。

收集TCGA 胰腺癌 ( n = 179)和GEPIA匹配正常組織以及胰腺組織（n = 171）驗證循環(huán)外泌體中發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)模式對胰腺癌和正常組織樣本的區(qū)分。HIST2H2AA3、LUZP6和HLA-DRA三個基因在胰腺腫瘤和正常組織之間存在統(tǒng)計學(xué)差異（p

考慮超過90%的PDAC病例中存在KRAS突變，進(jìn)一步探索這三個基因的水平與KRAS突變狀態(tài)的相關(guān)性。TCGA-PDAC數(shù)據(jù)顯示HIST2H2AA3表達(dá)水平在KRAS野生型和突變體之間差異顯著。

建立HIST2H2AA3、LUZP6和HLA-DRA的循環(huán)外泌體RNA特征的ROC曲線，胰腺癌與健康對照組的AUC為 0.8558 (95% CI: 0.82–0.89)，胰腺癌與慢性胰腺炎的AUC為0.815 (0.77–0.86) 和慢性胰腺炎與健康對照的AUC值為0.586 (0.51–0.66)。

3.腫瘤衍生外泌體特征的單細(xì)胞分析與預(yù)后和免疫治療反應(yīng)相關(guān)

題目：Single-cell analysis of a tumor-derived exosome signature correlates with prognosis and immunotherapy response

DOI：10.1186/s12967-021-03053-4

結(jié)合以前的研究，利用PCA算法整合腫瘤衍生的外泌體相關(guān)基因，定義一個新的腫瘤衍生外泌體的相關(guān)特征（TEXscore）?；趩渭?xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)對TEXscore特征進(jìn)行驗證。與三個模塊生成的外泌體相關(guān)簽名（Signature Score）分析結(jié)果一致，進(jìn)行性疾病（PD）狀態(tài)下的TEXscore顯著高于治療前（Pre）和部分緩解/疾病穩(wěn)定（PR/SD） 狀態(tài)評分。

在 GSE33479 隊列中對比正常樣本和癌癥樣，TEXscore從正常組織到浸潤性腫瘤樣本保持線性增加。為進(jìn)一步研究TEXscore與癌癥相關(guān)性，從泛癌中調(diào)查驗證腫瘤樣本和正常組織之間的TEXscore水平差異，結(jié)果顯示TEXscore在13種腫瘤的正常和腫瘤樣本中均存在異常顯著的差異，表明TEXscore與腫瘤特征相關(guān)。

除了樣本差異，也對TEXscore在各腫瘤種預(yù)后相關(guān)性做了評估。森林圖和Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果表明，TEXscore作為TCGA數(shù)據(jù)集中大多數(shù)癌癥類型預(yù)后的不利因素。在TCGA-LUSC、TCGA-LUAD、TCGA-STAD、TCGA-BLCA以及TCGA-Pan-Cancer中低TEXscore組的總體生存率更好。

使用GEO數(shù)據(jù)集（胃癌GSE62254和肺癌GSE30219）進(jìn)行驗證，分析結(jié)果基本一致。

免疫檢查點(diǎn)阻滯劑（ICB）對于腫瘤治療有著令人驚訝的效果，因此也就誕生了非常多的預(yù)測性生物標(biāo)志物以區(qū)分能夠受益于ICB治療的患者，但是預(yù)測的能力卻總是差強(qiáng)人意。這里也以TEXscore對ICB進(jìn)行預(yù)測分析。結(jié)果顯示，TEXscore 的預(yù)測能力優(yōu)于多個效應(yīng)器。在分析膀胱癌預(yù)后中，雖然TEXscore給出的AUC值并不理想，但是Kaplan-Meier曲線表明，較高的TEXscore與IMvigor210中延長的存活時間有關(guān)。另外，TEXscore也顯示與腫瘤細(xì)胞（TC）中PD-L1水平的升高相關(guān)。

使用 IMvigor210 隊列中高和低TEXscore亞組之間的DEG進(jìn)行功能富集分析。GO功能富集發(fā)現(xiàn)高TEXscore亞組中上調(diào)的基因富集于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑相關(guān)通路。基因集富集分析（GSEA）和KEGG分析高TEXscore亞組中上調(diào)的基因主要富集于腫瘤相關(guān)的信號通路。

已經(jīng)證明TEXscore與免疫抑制微環(huán)境之間的相關(guān)性。為進(jìn)一步研究外泌體介導(dǎo)的免疫細(xì)胞浸潤模式，整合了涵蓋巨噬細(xì)胞、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）、髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT） 和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg） 的綜合免疫抑制特征，以表征 TEXscore 和腫瘤微環(huán)境。TCGA數(shù)據(jù)集中TEXscore在不同腫瘤類型的免疫抑制微環(huán)境模式差異較大，但是TEXscore在大多數(shù)癌癥類型中與廣泛的免疫抑制特征以及免疫治療抗性特征表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。

大量研究表明miRNA作為外泌體傳遞的重要物質(zhì)，廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。以TEXscore和miRNA之間的關(guān)系為出發(fā)點(diǎn)，進(jìn)一步研究TEXscore的腫瘤相關(guān)性?？傆嬍珍?882個miRNAs，在高TEXscore組中顯示為顯著下調(diào)。另外選擇前10個陰性miRNA下游靶基因2628個用于GO和KEGG富集分析，結(jié)果顯示GO功能富集在神經(jīng)發(fā)生過程中，包括軸突形成、突觸組織和神經(jīng)元投射等。而KEGG富集，除了ECM重塑機(jī)制，高TEXscore組也表現(xiàn)出與Ras信號通路、PI3K-Akt信號通路和 MAPK信號通路等腫瘤惡性通路富集作用。

TEXscore結(jié)合常見基因的基因組譜分析遺傳突變狀態(tài)。TEXscore與TCGA-LUAD隊列中STK11突變率，TCGA-STAD和TCGA-CESC中的野生型TP53負(fù)相關(guān)。整個 TEXscore基因改變率分析結(jié)果顯示，TCGA-LUAD 的高TEXscore亞組中觀察到高EGFR改變頻率，而低TEXscore亞組主要是STK11突變，表明STK11和EGFR介導(dǎo)對外泌體分泌的相反作用。