基因檢測作為近兩年才興起的新興行業(yè)，尤其是基因檢測項目越來越多地應用于醫(yī)學臨床的情況下，臨床分子診斷的質(zhì)量問題也日益凸顯，成為眾人矚目的焦點。目前在臨床應用中，存在同一實驗室不同檢測批次間或不同實驗室對同一標本檢測結果的差異，這已成為時常困擾臨床醫(yī)師、患者以及實驗室技術人員的普遍性問題。

國家對基因檢測的監(jiān)管也越來越嚴格。由于基因檢測企業(yè)基本都是由生物學家創(chuàng)建，從業(yè)人員也大多為生物專業(yè)人士，過去可能更重視技術，不重視質(zhì)量。但隨著基因檢測實驗室納入醫(yī)學檢驗體系，越來越多的基因檢測項目有了全國性的質(zhì)量評價活動，基因檢測企業(yè)除了注重技術的發(fā)展之外，對于實驗室質(zhì)量體系建設也越來越重視?；驒z測企業(yè)要發(fā)展，必須把技術和規(guī)范進行同等重視，才能擁有更多的發(fā)展機會。

二O一六年十一月，國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心發(fā)布了2016年全國腫瘤游離DNA（ctDNA）基因突變檢測室間質(zhì)量評價調(diào)查活動結果報告。

PT成績?yōu)?00分的實驗室（排名順序不分先后）

實驗室PT成績情況總體統(tǒng)計分析

NGS滿分率只有39.5%，合格率為79%，所有方法合計滿分的實驗室占50%，合格率為82%。從臨床質(zhì)量要求來看還有提高的需求和空間，同一患者的腫瘤基因檢測結果如果各家結果不同，會使臨床醫(yī)生以及患者對基因檢測產(chǎn)生懷疑，所以追求質(zhì)量的提高，已經(jīng)是所有基因檢測實驗室必須樹立的目標。

分子診斷實驗室建設與質(zhì)量控制

Vol.1

臨床分子實驗室的布局

臨床分子實驗室必須保證基因擴增檢驗質(zhì)量和保障生物安全，在布局、設置、使用及管理等方面均需符合國家關于臨床基因診斷實驗室管理暫行辦法；臨床基因診斷實驗室工作規(guī)范；臨床基因診斷實驗室基本設置標準及微生物和生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則等臨床基因診斷實驗室的設置要求。

該實驗室設計的核心是避免污染，應具備簡潔的外觀、合理的結構布局、標準的風向設置以及嚴密的防護措施等。設計包括試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、PCR擴增區(qū)、分析區(qū)4個獨立實驗區(qū)，其各自均設置緩沖區(qū)和3個系統(tǒng)（單向氣流系統(tǒng)、單向物品傳遞系統(tǒng)和生物安全控制系統(tǒng)）。

1.1 結構布局設計

主體結構采用輕質(zhì)砌磚墻（?；u貼面）和鋼化玻璃等材料為分隔，頂面采用輕質(zhì)材料修建而成，設有總緩沖走廊及試劑配制區(qū)、標本處理區(qū)、PCR擴增、分析區(qū)4個獨立實驗區(qū)。各實驗區(qū)域設置緩沖區(qū)并配有更衣柜和洗手池，易于清潔消毒。

（1）試劑配制區(qū)，該區(qū)域為配制實驗試劑的場所。如PCR反應體系：常用30μl、50μl，各種成分的實際用量應根據(jù)實驗者選用的該成分的終濃度及所擁有的儲備液濃度進行核算。

（2）標本處理區(qū)，在實驗室中標本接收和處理的場所，該區(qū)域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸（DNA、RNA）的提取、純化、儲存及RNA的逆轉(zhuǎn)錄操作。（3）PCR擴增區(qū)，理論上說20 ～ 25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產(chǎn)率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20 ～ 30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，特異性增加。（4）分析區(qū)，分析結果的場所，該區(qū)域合并有通過LIS發(fā)放報告功能。 人員、物品進出各個實驗操作區(qū)均有各自獨立通道，實驗操作區(qū)之間的試劑及模板傳遞通過具有紫外線消毒功能的傳遞窗進行單向傳遞。通過合理的結構及布置，實現(xiàn)了臨床分子實驗室的分區(qū)要求。 各實驗操作區(qū)吊頂內(nèi)具備集中抽風系統(tǒng)，使得各操作區(qū)域相對緩沖區(qū)形成相對負壓，各室氣流單向流動，經(jīng)由集中式排風管道外排。設置室間傳遞窗可使樣本模板及試劑單向流動。

1.2 實驗室氣流控制

為避免各個試驗區(qū)域間交叉污染，氣流宜采用全送或全排的形式，同時應嚴格控制送、排風的比例以保證各實驗區(qū)的壓力要求。實驗室設計基于控制標本污染和生物安全防護的要求，在各實驗操作區(qū)中安置有全排式單向氣流控制系統(tǒng)。

該系統(tǒng)由吸頂排風扇、專用排風管道及樓頂風機組成，根據(jù)各操作區(qū)域面積大小，設置不同數(shù)量的排風扇，力求各區(qū)域氣壓平衡，所形成的氣流方向為總緩沖走廊空氣流向各緩沖區(qū)域，各緩沖區(qū)域空氣流向各實驗操作區(qū)域。

排風系統(tǒng)工作時各實驗操作區(qū)域氣體通過排風扇及風管外排，相對各緩沖區(qū)和總緩沖區(qū)為負壓狀態(tài)，實現(xiàn)各區(qū)域氣流的單向流動。

1.3 各區(qū)域間物品單向傳遞

在試劑準備區(qū)域與標本制備區(qū)域與PCR擴增區(qū)域與分析區(qū)域之間安置有紫外線燈的機械連鎖不銹鋼傳遞窗，分別用于試劑、標本模板等的單向傳送。

試劑配制區(qū)所配置的試劑通過傳遞窗單向傳遞到PCR擴增區(qū)，處理過的標本模板通過單向傳遞到PCR擴增區(qū)，并在超凈工作臺內(nèi)進行加樣后上機擴增。

注意：PCR擴增區(qū)的任何物品均不進入其他各個區(qū)域。

Vol.2

臨床分子實驗室的生物安全控制

2.1 二級生物安全柜

二級生物安全柜如采用Thermo A2型，其內(nèi)部潔凈度可達100級。排風量為330CFM（流量單位，1CFM=28.3185L/min），其高效過濾器對0.3μM的顆粒過濾率>99.999%，可有效防止氣溶膠對標本的污染及對人員和環(huán)境的危害。

2.2 完善的消毒制度及單向氣流控制

（1）4個實驗操作區(qū)和各緩沖區(qū)按照衛(wèi)生部WS/T367醫(yī)療機構消毒技術規(guī)范空氣消毒的具體要求安裝紫外線燈、生物安全柜、超凈臺和傳遞窗內(nèi)部紫外線燈。在各實驗操作區(qū)內(nèi)另外配置移動紫外消毒車1臺以及局部補充消毒，需定期保潔紫外線燈管，每半年檢測其強度，若不符合標準立即更換。

（2）實現(xiàn)各實驗操作區(qū)域相對負壓狀態(tài)和氣流單向流動，保證各實驗操作區(qū)空氣相互流通。

2.3各操作區(qū)域間物品單向傳遞及廢棄物品

（1）試劑和標本通過各自專用傳遞窗單向傳遞到擴增區(qū)。各實驗操作區(qū)人員固定，操作服、鞋帽、口罩手套、儀器設備及實驗器具均單獨配置，杜絕跨區(qū)域使用。

（2）各實驗操作區(qū)域所有廢棄物包括剩余標本、廢液、廢棄耗材及反應物等均經(jīng)0.5%過氧乙酸溶液浸泡消毒后再經(jīng)各自路徑送出，經(jīng)高壓蒸汽滅菌處理后由醫(yī)院相關規(guī)定統(tǒng)一收集處理，以保障環(huán)境安全。

建立全面的實驗室質(zhì)量管理體系：質(zhì)量管理體系是把實驗室的質(zhì)量方針目標、組織架構、設施環(huán)境、儀器設備、試劑耗材、人員的權利職責、作業(yè)程序、管理程序、質(zhì)量保證、信息系統(tǒng)、文件控制、結果報告、咨詢服務、投訴處理、糾正改進等要素全面協(xié)調(diào)起來的統(tǒng)一整體。質(zhì)量體系是否完善直接關系到患者及送檢醫(yī)師對分子病理實驗室各項檢測結果報告的可信度和滿意度。因此必須將包括管理文件、程序文件和作業(yè)指導書（SOP）在內(nèi)的質(zhì)量體系文件，傳達至所有相關人員，保證相關人員充分理解并執(zhí)行此文件。更為重要的是，要對日常檢測工作流程進行全過程質(zhì)量控制，保證檢測結果的準確客觀。（1）檢測前的質(zhì)量保證：除了實驗人員要熟悉SOP文件，環(huán)境設施和儀器試劑需符合質(zhì)量要求外；分子病理檢測對象通常為核酸，樣本的前處理包括采集、處理、保存是否得當尤其重要。如手術標本離體后要及時取材并用pH值為7.2～7.4的4％中性緩沖甲醛固定，固定液用量通常為標本體積的10倍，固定時間視標本大小而定、一般為6-48h，避免因固定時間不足或過長影響組織結構完整性或破壞組織抗原，造成FISH等實驗結果不理想，淋巴瘤基因重排檢測用的骨髓、血樣本必須用EDTA抗凝，4℃保存；人乳頭狀瘤病毒（HPV）檢測的宮頸脫落細胞樣本一經(jīng)采集，應盡快送檢，一般室溫保存不超過12h，4℃保存不超過7d，-20℃保存不超過3個月。又如RT-PCR室驗對樣本的要求是，新鮮組織必須盡快地進行去RNA酶處理或置液氮凍存，防止RNA降解而致檢測失敗。檢測前必須仔細核對檢測申請單中所填的信息，接收樣本后必須由接收人簽名確認，保證其編號與送檢樣本編號一致。（2）檢測中的質(zhì)量保證：不論是采用國際或國家標準中發(fā)布的、或由權威技術組織指定的方法，還是用自己新設計開發(fā)的非標準方法、或經(jīng)擴充和優(yōu)化修改過的標準方法，實驗室應根據(jù)檢測項目的原理、適用范圍、檢測靈敏度、準確性、特異性和重復性對檢測方法進行確認。并通過與其他方法進行比對獲得客觀數(shù)據(jù)，驗證該檢測方法是合適可行的，且檢測結果也是準確可靠的。例如以指導靶向用藥治療為主要目的的腫瘤基因突變檢測，若采用常規(guī)PCR Sanger直接測序法為本實驗室的檢測方法時，可與具有相同檢測目的的即時熒光定量PCR方法進行比較，以獲得預期結果的一致性和檢測限度等信息。又如實驗室引進一套全自動原位雜交染色系統(tǒng)用于HER2基因的常規(guī)檢測以指導臨床靶向用藥治療，對于同樣的檢測項目相較手工操作方式而言，無論在設備、試劑以及操作程序上已發(fā)生很大改變。作為一項新的檢測平臺的建立，實驗室應制定相關方法學的驗證程序、按相應儀器操作規(guī)程和檢測項目的標準操作程序從設備性能、試劑質(zhì)量、檢測流程等方面來驗證HER2基因檢測結果的可比性，加強實驗室室內(nèi)質(zhì)量控制，做到每一項分子病理檢測都有相應標準操作程序，每一臺儀器設備的運行、維護、校準都是按照規(guī)定的程序操作的。每次檢測都必須帶有質(zhì)控對照，如陽性對照、陰性對照等。此外，還應參加實驗室間的質(zhì)量比對計劃，即做好室間質(zhì)量評價，這可以是由外部質(zhì)量評審機構如衛(wèi)生部病理質(zhì)量控制評價中心、各省市臨床病理質(zhì)量控制中心和臨檢中心等計劃組織的活動，也可以通過與其他實驗室交換樣品來進行。如質(zhì)評結果不能達到控制標準，實驗室管理層要及時參與實施糾正措施。實驗室應有這些室間質(zhì)量評價結果的記錄、并形成文件保存。（3）檢測后的質(zhì)量保證：取得檢測結果后由被授權的分子病理醫(yī)師進行分析審核并發(fā)布結果。實驗后剩余的樣本如DNA、白片等可按規(guī)定繼續(xù)保存，以備重復實驗。不再用于檢測的樣本按實驗室廢棄物的處理程序進行處理。（4）結果報告的發(fā)放：分子病理醫(yī)師應在規(guī)定的時間內(nèi)按規(guī)范的格式簽發(fā)分子病理檢測報告。因特殊情況造成檢測結果未能及時獲得并可能影響到患者的診斷或治療時，可通過發(fā)推遲報告形式通知送檢醫(yī)師，并及時采取糾正措施，盡快發(fā)放最終報告。對于檢測項目的臨床意義、檢測結果的評判原則、送檢樣本的注意事項、檢測結果的適當解釋，在送檢醫(yī)師或患者咨詢時要耐心地溝通交流。定期收集臨床科室對實驗室日常工作及檢測結果的建議和要求，提出改進措施，保證每一道工作流程都在質(zhì)量控制范圍之內(nèi)。

除了符合臨床檢驗中心的質(zhì)量要求，實驗室還應該按照ISO15189規(guī)范管理并運行，積極申請ISO15189認證：

1、什么是ISO15189

ISO15189即《醫(yī)學實驗室-質(zhì)量和能力的要求》，由國際標準化組織（ISO）在2003年2月15日正式頒布，分別在2007年、2012年進行了改版，目前使用版本為ISO15189：2012。該標準是基于ISO9000系列標準以及ISO/IEC 17025：2005而制定的。ISO15189從文件名可看出其強調(diào)了兩個主題，即質(zhì)量和能力。質(zhì)量是每個實驗室的生存之本，保證質(zhì)量的前提是制定一套完善的質(zhì)量管理體系并嚴格按其實施，而支撐質(zhì)量的唯一因素則是能力，包括管理能力以及技術能。目前，在我國對醫(yī)學實驗室進行ISO15189認可的唯一權威機構是中國合格評定國家認可委員會（CNAS），現(xiàn)CNAS已將ISO15189：2012直譯成了中文，重新命名為CNAS-CL02：2012《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則》。

2、目前我國有多少醫(yī)學實驗室通過ISO15189認可

截止2016年4月30日，我國已有209家醫(yī)學實驗室通過了ISO15189認可。其中包括：167家醫(yī)院檢驗科、2家醫(yī)院核醫(yī)學科、1家醫(yī)院病理科、2家血液中心以及38家第3方獨立實驗室。國內(nèi)通過ISO15189認可最多的省份是上海，共34家；國內(nèi)第一家通過ISO15189認可的實驗室是中國人民解放軍總醫(yī)院臨床檢驗科。

3、為什么醫(yī)學實驗室想過ISO15189認可

1、提高醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力。醫(yī)學實驗室按照ISO15189的要求，搭建質(zhì)量管理體系，結合PDCA循環(huán)思路，可不斷完善工作流程以及提高工作效率。2、提高人員素質(zhì)。通過對標準的培訓，對人員的考核，對體系文件的學習，可大大提高實驗室人員的服務意識以及專業(yè)技能。使大家知道為什么要這么做，怎樣自覺的這么做，這么做了的好處是什么。3、增強社會知名度及市場競爭力。ISO15189既然是國際標準，通過其認可也間接證明了實驗室管理水平達到了國際標準，從而也進一步證明醫(yī)院的醫(yī)療質(zhì)量是很高的，因此必然會吸引大量病人到院就醫(yī)，提高醫(yī)院的經(jīng)濟效益及市場競爭力。4、避免醫(yī)療糾紛。實驗室根據(jù)ISO15189要求，建立一套完善、規(guī)范的質(zhì)量體系，實驗人員嚴格按程序文件進行標準化操作，對所有記錄以及實驗數(shù)據(jù)進行有效管理。確保在病人提出質(zhì)疑或索賠時，做到有據(jù)可依。5、與國際接軌，促進國際貿(mào)易。通過與國際組織、區(qū)域組織或國外認可機構簽署多邊或雙邊互認協(xié)議，促進實驗室檢測結果的國際互認，從而促進對外貿(mào)易。

Vol.3

ISO 15189質(zhì)量體系建立的時間安排

準備階段，時間1-2個月

1. 決定：

實驗室主任(管理層)要求以ISO 15189建立科室質(zhì)量管理體系。2. 相關文件：

國家認可委網(wǎng)站下載相關文件，如：

CNAS-CL02：2012《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則》

CNAS-CL02：2012《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則》

CNAS-CL05：2009《實驗室生物安全認可準則》

CNAS-CL43：2012《臨床血液學檢驗領域的應用說明》

CNAS-CL42：2012《臨床微生物學檢驗領域的應用說明》

CNAS-CL41：2012《體液學檢驗領域的應用說明》

CNAS-CL39：2012《臨床免疫學定性檢驗領域的應用說明》

CNAS-CL38：2012《臨床化學檢驗領域的應用說明》

CNAS-CL36：2012《分子診斷領域的應用說明》

CNAS-CL35：2012《實驗室信息系統(tǒng)的應用說明》

3. 動員會：

實驗室開展全體動員會，宣貫ISO15189質(zhì)量體系在科室的建立。4. 學習：

組織實驗室全體人員學習ISO15189相關文件，更好掌握文件相關內(nèi)容。

5. 文件編寫及注意事項：

實驗室質(zhì)量負責人安排相關人員，按最新版文件要求，對科室文件進行編寫，如：①質(zhì)量手冊

②程序文件

③臨床應用手冊

④安全手冊

5.1 按照現(xiàn)行2012版規(guī)定進行撰寫。

5.2 文件以2012版為基礎，并結合實驗室自身操作撰寫。

5.3 科室文件與標準文件規(guī)定的條款一致。注意：將認可準則轉(zhuǎn)化為實驗室的規(guī)定

6. 文件審核：

文件后撰寫完成后，組織相關人員一起對內(nèi)容核對修改，確保質(zhì)量手冊、程序文件的符合性。

7. 組織結構：

實驗室主任、質(zhì)量負責人、技術負責人、安全負責人、儀器管理員、試劑管理員、信息管理員、資料管理員，安全管理員等。注意：實驗室組織結構圖清晰

初級實施階段，時間2-3個月

1.專業(yè)組按相關規(guī)定使用第一批表格（科室層面的表格）按相關規(guī)定：

①溫濕度記錄

②冰箱（恒溫箱）等記錄

③標本交接記錄

④不合格標本記錄

⑤急診標本登記及報告記錄

⑥危急值報告記錄

⑦儀器維修記錄

⑧生物安全方面的相關記錄

……

2.以程序文件、CNAS-CL02：2012《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則》及各領域應用說明為基礎撰寫個專業(yè)組相關文件：

①專業(yè)組管理文件

②儀器SOP

③項目SOP

④性能驗證⑤專業(yè)組各種表格

注意：SOP條款必須滿足《ISO 15189：2012》中的條款。

3.第二批表格的進入：

實驗室相關表格及專業(yè)組表格。

4. 內(nèi)審：

組織科室內(nèi)審員以及特邀人員（無證的相關人員）對文件審核，確保程序文件與質(zhì)量手冊的符合性，對不符合項進行文件的整改并對文件定版。

5. 上報項目：

ISO 15189申報項目必須以下要求。

①參加衛(wèi)生部室間質(zhì)量評價合格

②嗍源性

③性能驗證

注意：上報項目不要一把抓，考慮第二年增加。

6. 管理評審：

通過管理評審，對管理體系進行調(diào)整，在轉(zhuǎn)入下一階段。

正式實施階段時間6個月

1. 文件按規(guī)定下發(fā)，組織人員學習文件，并表格規(guī)定填寫按照。

2. 各專業(yè)組按各專業(yè)組領域運用說明以及科室文件規(guī)定，全面開展質(zhì)量體系工作：

①室內(nèi)質(zhì)控

②室間質(zhì)評

③性能評價

④人員比對

⑤儀器比對

……注意：（所有均保留原始數(shù)據(jù)）

3. 儀器和試劑管理：

①儀器檔案（三證、驗收記錄、儀器履歷等）

②建立供應商名錄

③實驗室的計量器具驗證

④評價合格供應商

⑤建立實驗室儀器一覽表

⑥試劑驗收

⑦試劑出入庫

⑧試劑供應商一覽表

……

4. 人員培訓：

嚴格按照《ISO 15189：2012》文件規(guī)定建立人員培訓，要求培訓計劃、培訓的實施、考試考核和評估等。

注意：（所有均保留原始數(shù)據(jù)）

5. 期間進行內(nèi)審（審核文件的實施有效性），管理評審。

注意：（保留內(nèi)審、管理評審原始資料）

6. 自查：

嚴格按照《ISO 15189申報中的評審核查表》進行自查，整改，記錄每一次自查結果。

上報、認可階段

1、申報階段（交資料后3個月時間）

1.1 填寫階段：

整理文件，在認可委網(wǎng)上下載 申請表，嚴格按表上規(guī)定填寫，上報項目需填寫：中間精密度、重復性精密度、準確性等，填寫的須與測定的一致。注意：全部原始數(shù)據(jù)保留，沒有完成性能驗證不要考慮上報。1.2 認可委受理階段：

認可委是否受理，受理后文件評審，該階段要3個月時間（體系完全符合），認可委審核文件的符合性，全面性，如出現(xiàn)問題，文件將返回進行修改。1.3 認可委通過后：

通知實驗室派評審專家，此時實驗室可以提出意見。2、現(xiàn)場評審階段

2.1 認可委將文件發(fā)給專家組：

專家組人員會閱讀文件，如文件符合規(guī)定，同意現(xiàn)場評審。2.2 現(xiàn)場評審階：

根據(jù)實驗室所報專業(yè)，派相關評審專家進行審核，時間一般是3-4天，首次會議是專家組組長主持會議，實驗室主任用10分鐘時間匯報質(zhì)量體系情況，會后現(xiàn)場評審，組長由實驗室主任或質(zhì)量負責人陪同，各專業(yè)由專業(yè)組長陪同。

2.3 現(xiàn)場試驗：

一般在來審核的前一周，專家組人員會聯(lián)系實驗室準備現(xiàn)場試驗標本。根據(jù)實驗室開展項目、儀器、人員建立比對方案，實驗室人員按要求完成。

2.4 現(xiàn)場評審期間的考核（抽問）：

授權簽字人（必考）、試劑管理員、資料管理員、儀器管理員等。2.5 現(xiàn)場檢查后：

實驗室協(xié)助專家組填寫檢查情況。注意：建立質(zhì)量體系通過認可后，體系要堅持，形成規(guī)范的流程，一年以后進行15189監(jiān)督評審，除了資料填寫不一樣，其他流程一樣。2年一次復審，復審期間一般要增報項目。

Tips：認可委規(guī)定，申請資料存在以下任何一種情況，會被認為實驗室存在誠實性問題：a.提供的申請資料自相矛盾，或與實際情況不符，例如申請并不具備的能力。b.管理體系文件有明顯抄襲痕跡，如體系文件中涉及了實驗室并不從事的活動或不存在的部門。c.不同實驗室提供的相關記錄雷同，或同一實驗室提供的不同時間的質(zhì)量記錄（如內(nèi)審、管理評審記錄）內(nèi)容雷同。d.實驗室質(zhì)量記錄在筆跡、內(nèi)容等方面有明顯造假痕跡。e.其他對實驗室申請資料真實性有懷疑的情況。